BioFine

В предыдущей главе мы ввели понятия неподвижной и подвижной фаз при хроматографии. Далее было установлено, что для разделения веществ, нанесенных на колонку в виде смеси, необходимо, чтобы для каждого из компонентов этой смеси установилось динамическое равновесие концентраций между двумя фазами.

Эти равновесия должны быть сильно сдвинуты в сторону неподвижной фазы. В ионообменной хроматографии такой сдвиг происходил за счет электростатической, ионной связи каждого из веществ с твердой хроматографической матрицей.

С током подвижной фазы (элюента), уносящей растворенные в ней вещества, все эти равновесия нарушаются и немедленно восстанавливаются (на более низком уровне концентраций) за счет частичного выхода из неподвижной фазы каждого из веществ.

Слоем ниже идет обратный процесс - динамические равновесия устанавливаются за счет перехода веществ из подвижной фазы в неподвижную до тех пор, пока эти новые равновесия не достигнут наивысшего уровня концентраций. После чего снова начинается вымывание веществ элюентом, точно такое же, как происходило в вышележащем слое, который тем временем опустошается.

Так происходит перемещение связанных с матрицей зон различных веществ вниз по колонке. Эти зоны движутся с различными скоростями, что обусловлено различием сил связывания каждой из них с матрицей и, соответственно, различием соотношений равновесных концентраций разделяемых веществ в неподвижной и подвижной зонах.

Повторное изложение сути хроматографического процесса имеет целью обратить внимание читателя на то, что в нем не фигурирует механизм связи веществ с матрицей.

Собственно говоря, не заявлена даже необходимость такой связи, а только условие различия равновесных концентраций в двух зонах, специфическое для каждого из фракционируемых веществ.

Такое условие может быть выполнено и другими способами. Например, можно использовать различие растворимостей этих веществ в разных растворителях. Гидрофильные вещества, имеющие на поверхности своих молекул поляризованные участки или ионы. Они хорошо растворимы в воде и плохо - в органических растворителях.

Гидрофобные же вещества плохо растворимы в воде и хорошо - в органике. Были даже названы наиболее типичные из гидрофобных веществ: алифатические цепочки вида СНз-CH2-CH2 . и ароматические молекулы - замкнутые циклы с сопряженными связями типа бензола или фенола.

Следует заметить, что абсолютной нерастворимости не бывает. Гидрофильные вещества плохо, но все-таки растворяются в органических растворителях. То же самое относится и к взаимоотношениям гидрофобных веществ и воды.

Представим теперь себе колонку, заполненную целлюлозой, набухшей в воде. Внутри гранул такой целлюлозы тоже будет находиться неподвижная вода. Потом пропустим через эту колонку фенол, который заполнит пространство между гранулами.

Наконец внесем на эту колонку смесь гидрофильных веществ, хотя бы обычных водорастворимых белков. Большая их часть немедленно "укроется" в неподвижной водной фазе внутри гранул. Малая же их доля (для разных белков - разная) все-таки растворится в феноле. Установятся динамические равновесия концентраций белков, отвечающие соотношениям их растворимостей, во всех случаях сильно сдвинутые к неподвижной фазе. Но это и есть условие реализации колоночной хроматографии.

Можно надеяться, что если достаточно долго подавать на такую колонку фенол в качестве элюента, то в конце концов на выходе из колонки появятся разделенные между собой, очень пологие пики наших белков, растворенных в феноле.

Это - "распределительная хроматография". основанная на различии растворимостей. Исторически такое распределение, когда водная фаза находится внутри гранул, а элюентом служит органический растворитель, названо "нормальнофазовой" хроматографией. Она широкого распространения не получила.

Также смотрите:

Регенерация у человека и животных
Способность к регенерации широко распространена среди животных. Вообще говоря, низшие животные чаще способны к регенерации, чем более сложные высокоорганизованные формы. Так, среди беспозвоночных гораздо больше видов, способных восстанавливать утраченные органы, чем с ...

Введение генов в клетки млекопитающих
Манипуляции с клетками млекопитающих можно разделить на 2 большие группы: эксперименты с соматическим клетками и эксперименты по трансформации половых клеток. В последнем случае конечный результат – получение трансгенных организмов. Характеристика векторов для перено ...

Связь с мембраной
G-белки локализованы на внутренней поверхности плазматической мембраны. Первичная структура всех субъединиц G-белков не содержит гидрофобных, пронизывающих мембрану доменов. 1. Ассоциации G-белков с мембраной содействует ацилирование жирнокислотными радикалами. Выявл ...