Определение физико-химических свойств ферментовСтраница 1
Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.
При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ºС с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).
Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.
|
Буферы/растворы |
Применение |
Состав | |
|
Компоненты |
Концентрация | ||
|
TBE, 5× |
Электрофорез ДНК в агарозном геле |
Трис-HCl Борная кислота ЭДТА, рН 8.0 |
0.445 М 0.445 M 0.01 М |
|
ТЕ-буфер |
ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 |
1 мМ 10 мМ | |
|
10×ПЦР буфер |
ПЦР |
Трис-НСl, рН 8.9 (NH4)SO4 MgCl2 Tween 20 |
670 мМ 170 мМ 1.5 мM 0.1% |
|
10×лигазный буфер |
Лигирование фрагментов ДНК |
Трис-HCl, рН 7.8 MgCl2 DTT АТФ БСА |
500 мМ 100 мМ 100 мМ 10 мМ 250мкг/мл |
|
Раствор I |
Выделение плазмидной ДНК |
Глюкоза ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 |
50 мМ 10 мМ 25 мМ |
|
Раствор II |
Выделение плазмидной ДНК |
NaOH SDS |
0.2 N 0.1% |
Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.
|
Плазмиды |
Описание |
Ссылка |
|
pCM160 |
OriT, OriV, Plac, PmxaF, LacZ’, KmR |
Marx and Lidstrom, 2001 |
|
pET/ectA |
Ген ectA из M. marina встроен в pET28b+ |
Данная работа |
|
pZero-2 |
OriP, OriF1, Plac, KmR |
“Invitrogen” |
|
pZero/ectA |
Ген ectA из M. marina встроен в pZero |
Данная работа |
|
pBSL-180 |
Мини-Tn10 транспозон: ori R6K, mob, nptII R, ampR, lacI, tnp |
M. F. Alexeyev, 1994 |
|
pBSL-180/pmax/ectABC |
Гены pmax/ectABC встроены в pBSL180 |
Данная работа |
Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.
|
Праймер |
Ген - мишень |
Последовательность (5’-3’) | |||
|
EctHal EctA(halN) EctA(halC) ectArev ectF HalR HalF Tra3 Hal-REV2 CR Rtn Askn Askg AskF Hal-AskF(ad) Hal-REV2 Ect-operN(hal) Ect-operC(hal) Ect-operC2(hal) RevHal HalEctR-C C 20 PmaxF PmaxR TF TR vect57 vect53 |
ectA ectA ectA ectA ectA ectB ectB ectB ectB ectC ask ask ask ask ask ask ectABC ectABC ectABC ectR ectR адаптор pmax pmax pZero pZero
|
TTYGT(I)TGGCARGTNGC TTCCATGGCCAAAGACGTGAACGAGAT TTAAGCTTGGCTGCGGCCGAAGTC GCAGCAGCTCAATTAAC GATGGTGGTATTGAGGAGCTGC ACCATRTCYTCRAA CGGCTTTCGTATCGGTGTGC ACCGG(T/C)ACITT(C/T)TT(C/T)AGITT(C/T)GA GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC GGIGG(A/G)TT(A/G)AANAC(A/G)CA ACCATRTCYTGYTCRAA TGTCGCCGATCAGECTTCCAAC CCTTGTGGATGATCGCCTCGA TGCTGCTGGAACACAAGAAATC CGAGGCGATCATCCAGGAGTTC GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC TTGAATTCATTAGTTAGTAGGACAAGCAA TTTGGGCCCACGCGCGACATCGAAGTGC TTAAGCTTACGAGCGACATCGAAGTGC TTCCGACAAGGCGCATTACAAGC TTTAAGCTTCAGGCGGTCATCC CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA TTGGTACCGCTTGTCGGGCCGCTTGC TTGAGCTCATCCGCGGTATCTCTCAGACGTT CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTT GAGAGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGGAG AGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGCTAG CTCTCCCTTCTCGAATCGTAACCGTTCGTAC GAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC |
Также смотрите:
Выводы
Из всего выше изложенного можно сделать выводы:
1. Ондатра – это экологически пластичный вид, она самостоятельно и успешно расселяется во всех водно-болотных угодьях страны, этот зверёк очень плодовит и размножается около трех раз за сезон, организованный зверёк, им ...
Определение способности роста на средах с добавлением поверхностно-активных
веществ
Для определения способности роста на средах с добавлением различных ПАВ использовался чашечный метод. Производился глубинный посев по 1 мл бактериальной суспензии. Использовалось 2 среды: питательный агар и среда М9 (рецепты сред см. в приложении). В качестве селектив ...
Спектр совместимых растворимых веществи их распространение у
микроорганизмов
Спектр совместимых растворимых веществ, обнаруженных у прокариот и эукариот, весьма широк и разнообразен (Roberts, 2004; 2005). Термин “совместимые растворимые вещества” был предложен для соединений, которые не ингибируют метаболические процессы, но защищают клетку и ...